Агым цитометриясы – клеткаларды терең талдоо үчүн колдонулган цитологиялык изилдөө ыкмасы. Анын артыкчылыгы ар бир клетканы өзүнчө изилдөөгө мүмкүндүк берет. Анализдин бул түрү бир нече секунданын ичинде жүздөгөн клеткалардын бир нече параметрлерин баалоого жардам берет. Натыйжада, цитофлюориметрия учурда илимпоздор жана клиникалар үчүн жеткиликтүү болгон анализдин эң тез жана так ыкмаларынын бири болуп эсептелет.
Принцип
Агымдын цитометриясынын принциби клеткалардын жарыктын чачырашын жана люминесценциясын (флуоресценциясын) өлчөөгө негизделген. Клетка суспензиясы цитометр клеткасы аркылуу жогорку ылдамдыкта агым катары өтүп, лазер менен нурлантылат. Гидродинамикалык фокустоо да ошол жерде аткарылат. Анын механизми, агымдагы изилденүүчү бөлүкчөлөр менен клеткадан чыгуу ылдамдыгы жогору болгон тышкы агымга агып турат. Натыйжада, бөлүкчөлөр иреттелген чынжырга тизилет.
Алдын ала клеткалар атайын флуоресценттик боёктор (фторхромдор) менен белгиленет. Алардын аркасында лазер нуруэкинчилик жарыкты козгойт. Кабыл алынган жарык сигналдары детекторлор тарабынан катталат. Кийинчерээк маалымат кээ бир критерийлер боюнча айырмаланган жеке клетка популяцияларын эсептөөгө мүмкүндүк берген программалык алгоритмдердин жардамы менен иштетилет.
Кадимки микроскопиялык изилдөөлөр көп учурда ар кандай клеткаларды айырмалай албайт, анткени алар окшош. Цитофлюориметрия башка маалыматтарды (ДНКнын структурасынын бүтүндүгүн) камсыздайт, белоктун экспрессиясын, клетканын жашоосуна анализ жасай алат.
Фторхромдорду дүүлүктүрүү үчүн ар кандай толкун узундуктагы жарык нурлары, ошондой эле детекторлордун ар кандай түрлөрү талап кылынгандыктан, заманбап установкалар бир нече аныктоо каналдары менен жабдылган (4төн 30га чейин). Лазердик эмиттердин саны 1ден 7ге чейин болушу мүмкүн. Татаал түзүлүштөр бөлүкчөлөрдүн бир нече касиеттерин бир эле учурда көп параметрлик изилдөөгө мүмкүндүк берет.
Артыкчылыктар жана кемчиликтер
Агым цитометриясынын артыкчылыктары төмөнкүлөрдү камтыйт:
- жогорку иштетүү ылдамдыгы (1 секундада 30 миң окуяны каттоо);
- көп сандагы клеткаларды изилдөө мүмкүнчүлүгү (үлгүдө 100 миллионго чейин);
- Флуоресценттик жарыктын интенсивдүүлүгүн эсептөө;
- ар бир клетканын анализи;
- гетерогендик процесстерди бир убакта изилдөө;
- клетка популяциясы боюнча маалыматтарды автоматтык түрдө бөлүү;
- натыйжалардын сапаттуу визуализациясы.
Бул технологиянын дагы бир өзгөчөлүгү – булталданган бөлүкчө бир нече флуоресценттүү эритмелер менен боелсо болот. Мунун аркасында көп параметрлүү изилдөө пайда болот.
Кемчиликтерге техникалык жабдуулардын татаалдыгы жана үлгүлөрдү атайын даярдоонун зарылдыгы кирет.
Цитометрлер
Бул типтеги биринчи аппараттар 1968-жылы Германияда пайда болгон, бирок алар кийинчерээк кеңири тараган. Учурда агымдык цитометрия ыкмасы менен иштеген бардык аппараттарды 2 түргө бөлүүгө болот:
- флуоресценттик нурланууну (эки же андан көп толкун узундуктары), 10° жана 90° жарык чачыранды (төмөн бурч жана каптал чачыратуу детектору) өлчөгөн түзмөктөр;
- түзмөктөр, алар бир нече уюлдук параметрлерди өлчөөдөн тышкары, автоматтык түрдө ушул критерийлерге ылайык топторго иргелет.
Алга чачыратуу детектору клетканын өлчөмүн аныктоо үчүн иштелип чыккан, ал эми капталдагы чачыратуу аппараты клетка ичиндеги гранулалардын бар экендиги, цитоплазманын жана ядронун көлөмдүк катышы жөнүндө маалымат алууга мүмкүндүк берет.
Классикалык цитометрлер жарык микроскопторунан айырмаланып, клетканын сүрөтүн алууга мүмкүндүк бербейт. Бирок акыркы жылдары микроскоптун жана цитофлюориметрдин мүмкүнчүлүктөрүн айкалыштыра алган комбинацияланган приборлор иштелип чыкты. Алар төмөндө талкууланат.
Сүрөттөө цитометрлери
Классикалык агым цитометриясында колдонулган аспаптар үчүн,бир өзгөчөлүгү мүнөздүү: эгерде сейрек кездешүүчү окуялар анализделген клеткалардын популяциясында катталса, анда алардын маңызы эмнеде экенин баалоого мүмкүнчүлүк жок. Бул бөлүкчөлөр өлгөн клеткалардын калдыктары же алардын сейрек кездешүүчү тобу болушу мүмкүн. Кадимки түзмөктөрдө мындай маалыматтар окуялардын жалпы агымынан чыгарылат, бирок алар илимий жана клиникалык анализ үчүн өзгөчө мааниге ээ болушу мүмкүн.
Сүрөттөөчү агым цитометрлеринин жаңы мууну детектор зонасы аркылуу агымда өткөн ар бир клетканын сүрөтүн тартууга мүмкүндүк берет. Компьютердин мониторунда көрсөтүлгөн диаграмманын тиешелүү жерин чыкылдатуу менен аны көрүү оңой.
Колдонуу аймактары
Агымды цитометрия – бул универсалдуу ыкма, ал медицинанын жана илимдин көптөгөн тармактарында колдонулат:
- иммунология;
- онкология;
- трансплантология (кызыл жилик чучугун, сөңгөк клеткаларды трансплантациялоо);
- гематология;
- токсикология;
- биохимия (клетканын ичиндеги кычкылдуулукту өлчөө, башка параметрлерди изилдөө);
- фармакология (жаңы дарыларды түзүү);
- микробиология;
- паразитология жана вирусология;
- океанология (суу объектилеринин абалын жана башка милдеттерди баалоо үчүн фитопланктонду изилдөө);
- нанотехнология жана микробөлүкчөлөрдүн анализи.
Иммунология
Адамдын иммундук системасы ар түрдүү клеткалардан турат. Иммунологиядагы агым цитометриясы алардын түзүмүн жана функцияларын баалоого, башкача айтканда, морфофункционалдык ишке ашырууга мүмкүндүк берет.анализ.
Мындай изилдөөлөр иммунитеттин татаал табиятын түшүнүүгө жардам берет. Клетка фенотиптери антигендер менен активдештирүү, патологиялардын өнүгүшү жана башка факторлордун натыйжасында өзгөрөт. Цитофлюорометрия комплекстүү аралашмадагы иммундук клеткалардын субпопуляцияларын бөлүп, убакыттын өтүшү менен алардын бардык өзгөрүүлөрүн баалай алат.
Онкология
Онкологиядагы эң маанилүү иштердин бири – клеткаларды түрүнө жараша дифференциялоо. Онкогематологияда агымдык цитометрия аркылуу анализ жүргүзүү принциби төмөнкү кубулушка негизделген: үлгүнү атайын флуоресценттик боёк менен иштеткенде, ал цитоплазмалык белоктор менен байланышат. Активдүү көбөйүүчү клеткаларда бөлүнгөндөн кийин анын мазмуну эки эсеге азаят. Демек, клетканын люминесценциясынын интенсивдүүлүгү эки эсеге азаят.
Көбөйгөн клеткаларды аныктоонун башка жолдору бар:
- ДНКны байланыштыруучу боёкторду колдонуу (пропидий йодид);
- белгиленген урацилди колдонуу;
- клетка циклин жөнгө салууга катышкан циклин белокторунун экспрессиясынын жогорулаган деңгээлин каттоо.
