Хроматография – заттарды бөлүү ыкмаларынын бири. Ал микробөлүкчөлөрдүн физикалык жана химиялык касиеттерин кийинки сапаттык жана сандык анализдөө үчүн колдонулат. Бул технологиянын бир өзгөрүшү жакындык хроматография болуп саналат. Молекулярдык жакындык касиетин колдонуу менен белок кошулмаларын дифференциациялоо идеясы илимде бир нече ондогон жылдар бою белгилүү. Бирок, ал өзүнүн өнүгүшүн акыркы жылдары, матрица катары колдонулган өтө порозиялуу гидрофиликтүү материалдарды ишке киргизгенден кийин гана алды. Бул ыкма аналитикалык маселелерди (заттарды бөлүү жана аларды идентификациялоо) да, даярдоочу маселелерди да (тазалоо, концентрациялоо) чечүүгө мүмкүндүк берет.
Эссенция
Афиндүүлүк хроматографиясы (латын сөзүнөн affinis - “жанында”, “байланышкан”) жакындык өз ара аракеттенүүсүнө негизделген, алар спасердик молекула (лиганд же аффинант) менен максаттуу молекуланын ортосундагы өзгөчө спецификалык байланыштардын түзүлүшү болуп саналат. Бул механизмдер табиятта кеңири таралган (медиаторлордун же гормондордун жана рецепторлордун байланышы, антителолор жанаантигендер, полинуклеотиддерди гибриддештирүү жана процесстердин башка түрлөрү). Медицинада жакындык хроматография 1951-жылдан бери практикалык максаттарда колдонулуп келет
Компоненттер төмөнкүчө бөлүнөт:
- изоляциялануучу затты камтыган жумушчу эритме сорбент аркылуу өткөрүлөт;
- сорбент матрицасында топтолгон лиганд бул затты кармап турат;
- ал топтолгон (топтолгон);
- сорбенттен изоляцияланган затты эриткич менен жууп алуу.
Бул ыкма бүт клеткаларды изоляциялоого мүмкүндүк берет. Салттуу сорбциялык хроматографиядан айырмасы, обочолонгон компоненттин сорбентке күчтүү биоспецификалык байланышы бар, ал жогорку селективдүүлүк менен мүнөздөлөт.
Адсорбенттер
Төмөнкү заттар адсорбент катары колдонулат:
- Агардан алынган полисахарид болгон агарозага негизделген гелдик бирикмелер. Көбүнчө 3 сорт колдонулат: сефароза 4В, CL (кайчылаш агароза) жана аффи-гель. Акыркы курамы агароза жана полиакриламиддин өзгөртүлгөн гели болуп саналат. Ал көбүрөөк биологиялык инерттүүлүккө, жогорку химиялык жана жылуулукка туруктуулукка ээ.
- Кремний диоксиди (силикагель).
- Айнек.
- Органикалык полимерлер.
Лиганддар менен контактта болгон механикалык тоскоолдуктарды жок кылуу үчүн аны алып жүрүүчүдөн (пептиддер, диаминдер, полиаминдер, олигосахариддер) бөлүү үчүн кошумча заттар колдонулат.
Жабдуу
Афиндик хроматография жабдыгы төмөнкү негизги блокторду камтыйт:
- мобилдик фаза үчүн резервуарлар (элюент);
- орточо берүү үчүн жогорку басым насостору (көбүнчө поршендик);
- элюенттерди чаңдан тазалоо үчүн фильтр;
- дозалоочу аппарат;
- аралашманы бөлүү үчүн хроматографиялык колонка;
- тилкеден чыккан бөлүнгөн компоненттерди аныктоо үчүн детектор;
- хроматограмма жазгычтар жана микропроцессордук блок (компьютер).
Эриген абанын көлөмүн азайтуу үчүн гелий алгач кыймылдуу фазадан өткөрүлөт. Элюенттин концентрациясын өзгөртүү үчүн программист башкарган бир нече насостор орнотулган. Хроматографиялык мамычалар дат баспас болоттон (коррозияга туруктуулукту жогорулатуу талаптары үчүн), айнектен (универсалдуу вариант) же акрилден жасалган. Даярдоо максатында, алардын диаметри 2ден 70 смге чейин өзгөрүшү мүмкүн. Аналитикалык хроматографияда Ø10-150 мкм микротилкелер колдонулат.
Детекторлордун сезгичтигин жогорулатуу үчүн аралашмага реагенттер киргизилет, алар спектрдин ультра кызгылт көк же көрүнөө аймагында көбүрөөк нурларды сиңирип алуучу заттардын пайда болушуна көмөктөшөт.
Методология
Суюктук жакындык хроматографиясынын 2 негизги түрү бар:
- Мамыча, мында мамы стационардык фаза менен толтурулган жана ал аркылуу аралашма агым менен өткөрүлөтэлюент. Бөлүнүү басым астында же тартылуу күчү астында болушу мүмкүн.
- Жука катмар. Элюент капиллярдык күчтөрдүн таасири астында жалпак адсорбент катмарын бойлой жылыйт. Адсорбент айнек табакка, керамика же кварц таякчасына, металл фольгага колдонулат.
Иштин негизги этаптары төмөнкүлөрдү камтыйт:
- адсорбентти даярдоо, лигандды алып жүрүүчүгө бекитүү;
- бөлүүчү аралашманы хроматографиялык колонкага берүү;
- мобилдик фазалык жүктөө, компонентти лиганд менен байланыштыруу;
- байланган затты бөлүп алуу үчүн фазаны алмаштыруу.
Бара турган жер
Афиндүүлүк хроматографиясы заттардын төмөнкү түрлөрүн бөлүп алуу үчүн колдонулат (колдонулган лиганддын түрү кашаада көрсөтүлгөн):
- ферменттик ингибиторлордун, субстраттардын жана кофакторлордун (ферменттердин) аналогдору;
- генетикалык жат белгилери бар биоорганикалык заттар, вирустар жана клеткалар (антителолор);
- жогорку молекулалуу углеводдор, моносахариддик полимерлер, гликопротеиндер (лектиндер);
- ядролук белоктор, нуклеотидилтрансферазалар (нуклеиндик кислоталар);
- рецепторлор, транспорттук белоктор (витаминдер, гормондор);
- клетка мембраналары (клеткалар) менен өз ара аракеттенген белоктор.
Бул технология иммобилизацияланган ферменттерди алуу үчүн да колдонулат жана аларды целлюлоза менен байланыштыруу иммуносорбенттерди өндүрүүгө мүмкүндүк берет.
ДНКны байланыштырган белоктордун хроматографиясы
ДНКны байланыштырган белокторду изоляциялоо аркылуу ишке ашырылатгепарин. Бул гликозаминогликан молекулалардын кеңири спектрин байланыштырууга жөндөмдүү. Бул топтун белокторунун жакындык хроматографиясы төмөнкүдөй заттарды бөлүп алуу үчүн колдонулат:
- котормонун башталышынын жана узартылышынын факторлору (нуклеин кислотасынын молекулаларынын жана белоктордун синтези);
- рестриктазалар (кош тизмектүү ДНКдагы белгилүү ырааттуулуктарды тааныган ферменттер);
- ДНК лигазалары жана полимеразалары (жаңы химиялык байланышты түзүү үчүн эки молекуланын кошулушун катализдөөчү жана ДНКнын репликациясына катышкан ферменттер);
- иммундук жана сезгенүү процесстеринде маанилүү роль ойногон серин протеаза ингибиторлору;
- өсүү факторлору: фибробласт, Шванн, эндотелий;
- клеткадан тышкаркы матрицанын белоктору;
- гормондук рецепторлор;
- липопротеиндер.
Кадыр
Бул ыкма реактивдүү кошулмаларды (ферменттер жана чоңураак агрегаттар - вирустар) бөлүп алуу үчүн эң спецификалык ыкмалардын бири болуп саналат. Бирок ал биологиялык активдүү заттарды бөлүп алуу үчүн гана эмес колдонулат.
Антителаларды аз өлчөмдө аныктоо, полиаденил кислотасын сандык баалоо, дегидрогеназалардын молекулалык массаларын тез аныктоо, кээ бир булгоочу заттарды чыгаруу, трипсиндин активдүү эмес формасын активдештирүү кинетикасын, адамдын молекулярдык түзүлүшүн изилдөө. интерферондор - бул жакындык колдонулган изилдөөлөрдүн толук тизмеси эмес, хроматография. Клиникада колдонуу анын артыкчылыктары менен шартталган, мисалы:
- Натыйжалуу тазалоо мүмкүнчүлүгүбелоктор, полисахариддер, нуклеиндик кислоталар. Алар физикалык жана химиялык касиеттери боюнча бир аз айырмаланат жана гидролиз, денатурация жана башка ыкмаларда колдонулган дарылоонун башка түрлөрү учурунда активдүүлүгүн жоготот.
- Заттардын бөлүнүү ылдамдыгы, процесстин динамикалык мүнөзү.
- Диссоциация константаларын аныктоо үчүн атайын ферментти тазалоонун жана изофермент гомогенизациясынын кереги жок.
- Кеңири диапазондогу заттарды бөлүүгө жөндөмдүү.
- Лиганддарды аз керектөө.
- Заттарды чоң көлөмдө бөлүү мүмкүнчүлүгү.
- Биологиялык макромолекулаларды бириктирүүнүн кайра жаралуучу процесси.
Бул ыкманы башкалар менен айкалыштырса болот, кошумча талаа (гравитациялык, электромагниттик) киргизүү үчүн. Бул хроматографиянын техникалык мүмкүнчүлүктөрүн кеңейтүүгө мүмкүндүк берет.
Ферменттик инженерия
Ушул методдун аркасында биотехнологиянын жаңы тармагы – ферменттик инженерия активдүү өнүгүүсү башталды.
Фермент изоляциясы үчүн жакындык хроматография төмөнкү артыкчылыктарга ээ:
- аз убакыттын натыйжасында ферменттерди көп санда алуу, натыйжада - алардын баасынын төмөндөшү;
- ферменттердин иммобилизациясы аларды медицинада жана өнөр жайда колдонуу чөйрөсүн кыйла кеңейтет;
- Ферменттердин эрибеген катуу таяныч менен байланышы табигый жана физиологиялык процесстерде маанилүү роль ойногон микрочөйрөнүн таасирин жана реакциялардын багытын изилдөөгө мүмкүндүк берет.
